滅菌是組織培養重要的工作之一。初學(xué)者要清楚有菌和無(wú)菌的范疇。有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，**少它的表面都是有菌的。依此觀(guān)點(diǎn)，無(wú)菌室等未處理的地方、超凈臺的表面、簡(jiǎn)單煮沸的培養基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個(gè)外表及與外界相連的內表，如整個(gè)消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養容器無(wú)論洗得多干凈等等都是有菌的。
這里所指的菌，包括細菌、真菌、放線(xiàn)菌、藻類(lèi)及其他微生物。菌的特點(diǎn)是：極小，肉眼看不見(jiàn)。無(wú)處不在，無(wú)時(shí)不有，無(wú)孔不入。在自然條件下忍耐力強，生活條件要求簡(jiǎn)單，繁殖力極強，條件適宜時(shí)便可大量滋生。
無(wú)菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒或一定時(shí)間蒸煮過(guò)后的物體，經(jīng)其他物理或化學(xué)的滅菌方法處理后的物體（當然這些方法必須已經(jīng)證明是有效的），高層大氣、巖石內部、健康的動(dòng)、植物的不與外部接觸的組織內部，強酸強堿，化學(xué)元素滅菌劑等表面和內部都是無(wú)菌的。從以上可以看出：在地球表面無(wú)菌世界要比有菌世界小的多。
滅菌是指用物理或化學(xué)的方法，殺死物體表面和孔隙內的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。與此相關(guān)的一個(gè)概念是消毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用，顯然經(jīng)過(guò)消毒，許多細菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不會(huì )完全殺死，即由于在消毒后的環(huán)境里和物品上還有活著(zhù)的微生物，所以通過(guò)嚴格滅菌的操作空間（接種、超凈臺等）和使用的器皿，以及操作者的衣著(zhù)和手都不帶任何活著(zhù)的微生物。在這樣的條件下進(jìn)行的操作，就叫做無(wú)菌操作。
植物組織培養對無(wú)菌條件的要求是非常嚴格的，甚**超過(guò)微生物的培養要求，這是因為培養基含有豐富的營(yíng)養，稍不小心就引起雜菌污染。要達到徹底滅菌的目的，必須根據不同的對象采取不同的切實(shí)有效的方法滅菌，才能保證培養時(shí)不受雜菌的影響，使試管苗能正常生長(cháng)。
常用的滅菌方法可分為物理的和化學(xué)的兩類(lèi)，即：物理方法如干熱（烘燒和灼燒）、濕熱（常壓或高壓蒸煮）、射線(xiàn)處理（紫外線(xiàn)、超聲波、微波）、過(guò)濾、清洗和大量無(wú)菌水沖洗等措施；化學(xué)方法是使用升汞、甲醛、過(guò)氧化氫、高錳酸鉀、來(lái)蘇水、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學(xué)藥品處理。這些方法和藥劑要根據工作中的不同材料不同目的適當選用。
1、培養基用濕熱滅菌
培養基在制備后的24小時(shí)內完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內溫度達121℃。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。
注意完全排除鍋內空氣，使鍋內全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到0.05MPa時(shí)，打開(kāi)放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。
關(guān)閥再通電后，壓力表上升達到0.1MPa時(shí)，開(kāi)始計時(shí)，維持壓力0.1-0.15MPa，20分鐘。
按容器大小不同，保壓時(shí)間有所不同，見(jiàn)表。該表所列數字是徹底滅菌很保險的數字，如果容器體積較大，但是放置的數量很少，也可以減少時(shí)間。
培養基高壓蒸汽滅菌所必需的**少時(shí)間
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容器的體積/mL |
在121℃滅菌所需**少時(shí)間/min |
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20-50 |
15 |
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75-150 |
20 |
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250-500 |
25 |
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1000 |
30 |
到達保壓時(shí)間后，即可切斷電源，在壓力到0.5MPa，可緩慢放出蒸汽，應注意不要使壓力降低太快，以致引起激烈的減壓沸騰，使容器中的液體四溢。當壓力降到零后，才能開(kāi)蓋，取出培養基，擺在平臺上，以待冷凝。不可久不放氣，引起培養基成分變化，以**培養基無(wú)法擺斜面。一旦放置過(guò)久，由于鍋爐內有負壓，蓋子打不開(kāi)，只要將放氣閥打開(kāi)，大氣壓入，內外壓力平衡，蓋子便易打開(kāi)了。
對高壓滅菌后不變質(zhì)的物品，如無(wú)菌水、栽培介質(zhì)、接種工具，可以延長(cháng)滅菌時(shí)間或提高壓力。而培養基要嚴格遵守保壓時(shí)間，既要保壓徹底，又要防止培養基中的成分變質(zhì)或效力降低，不能隨意延長(cháng)時(shí)間。
對于一些布制品，如實(shí)驗衣、口罩等也可用高壓滅菌。洗凈晾干后用耐高壓塑料袋裝好，高壓滅局20-30分鐘。
高壓滅菌前后的培養基，其PH值下降0.2-.3單位。高壓后培養基PH值的變化方向和幅度取決于多種因素。在高壓滅菌前用堿調高PH值**預定值的則相反。培養基中成分單一時(shí)和培養基中含有高或較高濃度物質(zhì)時(shí)，高壓滅菌后的PH值變化幅度較大，甚**可大于2個(gè)PH值單位。環(huán)境PH值的變化大于0.5單位就有可能產(chǎn)生明顯的生理影響。#p#分頁(yè)標題#e#
高壓滅菌通常會(huì )使培養基中的蔗糖水解為單糖，從而改變培養基的滲透壓。在8%-20%蔗糖范圍內，高壓滅菌后的培養基約升高0.43倍。
培養基中的鐵在高壓滅菌時(shí)會(huì )催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。培養基值小于5.5，其水解量更多，培養基中添加0.1%活性炭時(shí)，高壓下蔗糖水解大大增強，添加1%活性炭，蔗糖水解率可達5%。
為防止高壓滅菌產(chǎn)生的上訴一些變化可用下列方法：
（1）經(jīng)常注意搜集有關(guān)高壓滅菌影響培養基成分的資料，以便及時(shí)采取有效措施。
（2）設計培養基配方時(shí)盡量采用效果類(lèi)似的穩定試劑并準確掌握劑量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量（在0.1%以下）注意PH值對高壓滅菌下培養基中成分的影響等。
（3）配制培養基時(shí)應注意成分的適當分組與加入的順序。如將磷、鈣和鐵放在**后加入。
（4）注意高壓滅菌后培養基PH值的變化及回復動(dòng)態(tài)。如高壓滅菌后的PH值常由5.8升高**6.48。而96小時(shí)后又回降**5.8左右。這樣在實(shí)驗中就可以根據這一規律加以掌握。
2、用于無(wú)菌操作的器械采用灼燒滅菌
在無(wú)菌操作時(shí)，把鑷子、剪刀、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精燈火焰上灼燒滅菌。冷卻后，立即使用。操作中可采用250或500毫升的廣口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。
3、玻璃器皿及耐熱用具采用干熱滅菌
干熱滅菌是利用烘箱加熱到160-180℃
的溫度來(lái)殺死微生物。由于在干熱條件下，細菌的營(yíng)養細胞的抗熱性大為提高，接近芽孢的抗熱水平，通常采用170℃持續90分鐘來(lái)滅菌。
干熱滅菌的物品要預先洗凈并干燥，工具等要妥為包扎，以免滅菌后取用時(shí)重新污染。包扎可用耐高溫的塑料。滅菌時(shí)應漸進(jìn)升溫，達到預定溫度后記錄時(shí)間。烘箱內放置的物品的數量不宜過(guò)多，以免防礙熱對流和穿透，到指定時(shí)間斷電后，待充分冷涼，才能打開(kāi)烘箱，以免因驟冷而使器皿破裂。干熱滅菌能源消耗太大，浪費時(shí)間。
4、不耐熱的物質(zhì)采用過(guò)濾滅菌
一些生長(cháng)調節劑，如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些微生物是不耐熱的，不能用高壓滅菌處理，通常采用過(guò)濾滅菌方法。
一些化學(xué)成分在高溫高壓下回發(fā)生降解而失去效能或降低效能。經(jīng)高溫滅菌后赤霉素GA3的活性?xún)H及不經(jīng)高溫滅菌的新鮮溶液的10%。蔗糖經(jīng)高溫后部分被降解成D-葡萄糖和D-果糖，果糖又可被部分水解，產(chǎn)生抑制培養的植物組織生長(cháng)的物質(zhì)。高溫還可使碳水化合物和氨基酸發(fā)生反應。IAA，NAA，2，4-D、激動(dòng)素和玉米素在高溫下是比較穩定的。維生素具有不同程度的熱穩定性，但如果培養基的PH值高于5.5，則維生素B1會(huì )被迅速降解。泛酸鈣、植物組織提取物等要過(guò)濾滅菌，不能高溫滅菌，否則會(huì )失去作用。
防細菌濾膜的網(wǎng)孔的直徑為0.45微米以下，當溶液通過(guò)濾液后，細菌的細胞和真菌的孢子等因大于濾膜直徑而被阻，在需要過(guò)濾滅菌的液體量大時(shí)，常使用抽濾裝置；液量小時(shí)，可用注射器。使用前對其高壓滅菌，將濾膜裝在注射器的靠針管處，將待過(guò)濾的液體裝入注射器，推壓注射器活塞桿，溶液壓出濾膜，從針管壓出的溶液就是無(wú)菌溶液。
過(guò)濾除菌操作步驟：shou先將過(guò)濾器、接液瓶用紙包好，濾膜可放在培養皿內用紙包好。使用前先經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌30分鐘；在超凈工作臺上，將濾器裝置裝好，用滅菌無(wú)齒鑷子將濾膜安放在隔板上，濾膜粗糙面向上；然后將待除菌的液體注入濾器內，開(kāi)動(dòng)真空泵即可過(guò)濾除菌。濾液經(jīng)培養證明無(wú)菌生長(cháng)后可保存備用。
5、空間采用紫外線(xiàn)和熏蒸滅菌
（1）紫外線(xiàn)滅菌 在接種室、超凈臺上或接種箱用紫外燈滅菌。紫外線(xiàn)滅菌是利用輻射因子滅菌，細菌吸收紫外線(xiàn)后，蛋白質(zhì)很核酸發(fā)生結構變化，引起細菌的染色體變異，造成死亡。紫外線(xiàn)的波長(cháng)為200-300nm，其中260nm的殺菌能力**強，但是由于紫外線(xiàn)的穿透能力很弱，所以只適于空氣和物體表面的滅菌，而且要求距照射物以不超過(guò)1.2米為宜。
（2）熏蒸滅菌 用加熱焚燒、氧化等方法，使化學(xué)藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。這種方法簡(jiǎn)便，只需要把消毒的空間關(guān)閉緊密即可。
化學(xué)消毒劑的種類(lèi)很多，它們使微生物的蛋白質(zhì)變性，或競爭其酶系統，或降低其表面張力，增加菌體細胞漿膜的通透性，使細胞破裂或溶解。一般說(shuō)來(lái)，溫度越高，作用時(shí)間越長(cháng)，殺菌效果越好。另外，由于消毒劑必須溶解于水才能發(fā)揮作用，所以要制成水溶狀態(tài)，如升汞與高錳酸鉀。還有消毒劑的濃度一般是濃度越大，殺菌能力越強，但石炭酸和酒精例外。
常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時(shí)，房間關(guān)閉緊密，按5-8ml/m
3用量，將甲醛置于廣口容器中，加5g/m
3高錳酸鉀氧化揮發(fā)。熏蒸時(shí)，房間可預先噴濕以加強效果。冰醋酸也可進(jìn)行加熱熏蒸，但效果不如甲醛。#p#分頁(yè)標題#e#
6、一些物體表面用藥劑噴霧滅菌
物體表面可用一些藥劑涂搽，噴霧滅菌。如桌面、墻面、雙手、植物材料表面等，可用75%的酒精反復涂搽滅菌，1%-2%的來(lái)蘇兒溶液以及0.25%-1%的新潔爾滅也可以。
7、植物材料表面用消毒劑滅菌
從外界或室內選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶入培養基，便會(huì )造成培養基污染。因此，植物材料必須經(jīng)嚴格的表面滅菌處理，再經(jīng)無(wú)菌操作手續接種到培養基上，這一過(guò)程叫做接種。接種的植物材料叫做外植體（explant)。
shou先，將采來(lái)的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細洗干凈，如用適當的刷子等刷洗。把材料切割成適當大小，即滅菌容器能放入為宜。置自來(lái)水龍頭下流水沖洗幾分鐘**數小時(shí)，沖洗時(shí)間視材料清潔程度而宜。易漂浮或細小的材料，可裝入紗布袋內沖洗。流水沖洗在污染嚴重時(shí)特別有用。
洗時(shí)可加入洗衣粉清洗，然后再用自來(lái)水沖洗洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著(zhù)在植物表面的污物，除去脂質(zhì)性的物質(zhì)，便于滅菌液的直接接觸。當然，**理想的清洗物質(zhì)是表面活性物質(zhì)吐溫。
第二步是對材料的表面浸潤滅菌。要在超凈臺或接種箱內完成，準備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無(wú)菌水、手表等。用70%酒精浸10-30秒。由于酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，加之70%酒精穿透力強，也很易殺傷植物細胞，所以浸潤時(shí)間不能過(guò)長(cháng)。有一些特殊的材料，如果實(shí)、花蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽等等，以及主要取用內部的材料，則可只用70%酒精處理稍長(cháng)的時(shí)間。處理完的材料在無(wú)菌條件下，待酒精蒸發(fā)后再剝除外層，取用內部材料。
第三步是用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類(lèi)較多，可根據情況選取1-2種使用見(jiàn)下表。
常用滅菌劑使用濃度及效果比較表
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滅菌劑名稱(chēng) |
使用濃度% |
消毒難易 |
滅菌時(shí)間 |
滅菌效果 |
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酒精 |
70-75 |
易 |
0.1-3 |
好 |
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氯化汞 |
0.1-0.2 |
較難 |
2-10 |
**好 |
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漂白粉 |
飽和溶液 |
易 |
5-30 |
很好 |
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次氯酸鈣 |
9-10 |
易 |
5-30 |
很好 |
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次氯酸鈉 |
2（活性氧） |
易 |
5-30 |
很好 |
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過(guò)氧化氫 |
10-12 |
**易 |
5-15 |
好 |
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抗菌素 |
4-50mg/L |
中 |
30-60 |
較好 |
上述滅菌劑應在使用前臨時(shí)配制，氯化汞可短期內儲用。次氯酸鈉和次氯酸鈣都是利用分解產(chǎn)生氯氣來(lái)殺菌的，故滅菌時(shí)用廣口瓶加蓋較好；升汞是由重金屬汞離子來(lái)達到滅菌的；過(guò)氧化氫是分解中釋放原子態(tài)氧來(lái)殺菌的，這種藥劑殘留的影響較小，滅菌后用無(wú)菌水漂洗3-4次即可；由于升汞液滅菌的材料，難以對升汞殘毒去除，所以應當用無(wú)菌水漂洗8-10次，每次不少于3分鐘，以盡量去除殘毒。
滅菌時(shí)，不瀝干的植物材料轉放到燒杯或其他器皿中，記好時(shí)間，倒入消毒溶液，不時(shí)用玻璃棒輕輕攪動(dòng)，以促進(jìn)材料各部分與消毒溶液充分接觸，驅除氣泡，使消毒徹底。在快到時(shí)間之前1-2分鐘，開(kāi)始把消毒液傾入一備好的大燒杯內，要注意勿使材料倒出，氫凈后立即倒入無(wú)菌水，輕攪漂洗。滅菌時(shí)間是從倒入消毒液開(kāi)始，**倒入無(wú)菌水時(shí)為止。記錄時(shí)間還便于比較消毒效果，以便改正。滅菌液要充分浸沒(méi)材料。寧可多用些滅菌液，切勿勉強在一個(gè)體積偏小的容器中使用很多材料滅菌。
在滅菌溶液中加吐溫-80或Triton X效果較好，這些表面活性劑主要作用是使藥劑更易于展布，更容易浸入到滅菌的材料表面。但吐溫加入后對材料的傷害也在增加，應注意吐溫的用量和滅菌時(shí)間，一般加入滅菌液的0.5%，即在100ml加入15滴。
**后一步是用無(wú)菌水漂洗，漂洗要求3分鐘左右，視采用的消毒液種類(lèi)，漂洗3-10次左右。無(wú)菌水漂洗作用是免除消毒劑殺傷植物細胞的副作用。#p#分頁(yè)標題#e#
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滅菌原理
紫外線(xiàn)滅菌的原理:紫外線(xiàn)滅菌是用紫外線(xiàn)管照射進(jìn)行的。波長(cháng)在220-300納米的紫外線(xiàn)稱(chēng)為“殺生命區”，其中以260鈉米的殺菌力**強。紫外線(xiàn)作用于細胞DNA，使DNA鏈上相鄰的嘧啶堿形成嘧啶二聚體（如胸腺嘧啶二聚體），抑制了DNA復制。另外，空氣在紫外線(xiàn)照射下可以產(chǎn)生臭氧，臭氧也有一定的殺菌作用。紫外線(xiàn)透過(guò)物質(zhì)的能力很差，適用于空氣及物體表面的滅菌，與被照物的距離以不超過(guò)1.2米為易，照射時(shí)間以視紫外線(xiàn)燈管的功率大小、被照空間及面積大小，根據滅菌效果測定結果而定。由于紫外線(xiàn)對人體有傷害作用，因此，不要在紫外線(xiàn)燈照射下進(jìn)行操作。
氯化汞滅菌的原理：氯化汞也稱(chēng)升汞，是一種劇毒的重金屬鹽殺菌劑，其殺菌的原理是Hg2+可與帶負電荷的蛋白質(zhì)結合，使細菌蛋白變性，酶失活。氯化汞使用濃度0.1%-0.2%，浸泡6-12分鐘時(shí)，就可以有效地殺死附著(zhù)在外植體表面的細菌及真菌芽孢，滅菌效果極好。
但用氯化汞滅過(guò)菌的外植體材料要用無(wú)菌水反復多次洗滌（一般不少于5次），才可將殘留的藥劑除凈。使用氯化汞給環(huán)境造成污染，一般情況下，應盡量用其它消毒劑滅菌，而以少用或不用氯化汞為易。
次氯酸鈉滅菌的原理：次氯酸鈉又稱(chēng)為“安替福民”，活性氧含量是0.8%,使用時(shí)稀釋3-5倍,浸泡外植體5-30分鐘,再用無(wú)菌水洗滌4-5次.它分解出具有殺菌作用的氯氣,滅菌后易于除去,不留殘余,殺菌力強,對植物材料無(wú)害,是植物組織培養常使用的殺菌劑之一。
漂白粉滅菌的原理：漂白粉為白色粉末，一般含10%-20%（質(zhì)量/體積）的次氯酸鈣[Ca(ClO)2],使用時(shí)用飽和溶液，殺菌的原理在于它分解出具有殺菌作用的氯氣。氯與蛋白質(zhì)中的氨基結合，使菌體蛋白質(zhì)氧化，代謝功能發(fā)生障礙。注意漂白粉腐蝕金屬、棉織品，刺激皮膚，易吸潮散失有效氯而失效，平時(shí)要密封儲藏，**好現配現用，不要儲藏太久。
酒精滅菌的原理：酒精具有較強的穿透力和殺菌力，它使細菌蛋白質(zhì)變性。使用的濃度一般為70%-75%。處理時(shí)間15-30秒，不宜太長(cháng)，因為細胞容易收縮脫水。它具有浸潤和滅菌的雙重作用，適用于表面消毒，但不能達到徹底的滅菌，必須結合其它藥劑滅菌。
為了提高乙醇的殺菌效果，可在乙醇溶液中加入0.1%的酸或堿,以改變細胞表面帶電荷的性質(zhì)而增加膜透性,提高乙醇的殺菌效果。
高錳酸鉀滅菌的原理：高錳酸鉀能使細菌酶蛋白中的基氧化成二硫基而失去酶活性。濃度稀釋時(shí)起氧化作用殺死細菌，日常生活中通常用作皮膚、果蔬的表面消毒劑，在一盆清水中加幾粒高錳酸鉀就可起到殺菌的作用。
