1， 兩種滅菌方法
蒸汽-濕熱滅菌工藝開(kāi)發(fā)和應用，可采用兩種方法：過(guò)度殺滅法（the overkill method）和生物負載法（the bioburden method）。生物負載法也可稱(chēng)為存活概率法。
1.1 過(guò)度殺滅法
工業(yè)上蒸汽滅菌周期的設定和應用，一般使用過(guò)度殺滅法（the overkill method）。使用過(guò)度殺滅法的目標是確保達到一定程度的無(wú)菌保證，而不管裝載物的實(shí)際負載生物的數量多少和抗熱性如何。假定生物負載的數量和耐熱值設為如下水平：
N0＝106
D121＝1分鐘
Z＝10℃
為了達到無(wú)菌保證水平SAL小于10-6，NF＝10-6，利用上面這些數值，可以計算出為達到致死率所需的FPHY和FBIO如下：
F0＝D121×（LogN0－Log NF）＝12分鐘
很少發(fā)現自然生成的微生物擁有超過(guò)0.5分鐘的D121值。過(guò)度殺滅法假設的生物負載數量和抵抗力都要高于實(shí)際。大多數微生物的耐熱性都要比這低，因此能夠提供很高程度的無(wú)菌保證。
即便采用蒸汽-濕熱滅菌工藝為過(guò)度殺滅法（the overkill method），仍然需要對被滅菌產(chǎn)品的初始菌進(jìn)行周期監測，并定期采用生物指示劑測試。
1.2 生物負載法
通常來(lái)說(shuō)不耐熱產(chǎn)品或物品的滅菌就不能使用過(guò)度殺滅法了。這就需要我們所建立的滅菌周期必須能恰當地殺滅微生物負載，但是不能導致不可接受的產(chǎn)品分解。這樣的滅菌周期的建立就有賴(lài)于研究產(chǎn)品上的微生物數量和耐熱能力。一旦微生物負載的數量和耐熱能力得以明確，就可以設計出一個(gè)能達到SAL小于10-6的滅菌周期。
按CGMP規范生產(chǎn)的產(chǎn)品實(shí)際生物負載數量應該是很低的，每個(gè)包裝約在1～100CFU，對產(chǎn)品給予80～100℃下10～15分鐘熱休克，可以殺滅耐熱值低的微生物。例如：
產(chǎn)品的生物負載測試中，測得：
N0＝102
D121＝1分鐘
Z＝10℃
則達到無(wú)菌保證水平SAL小于10-6，NF＝10-6，利用上面這些數值，可以計算出為達到致死率所需的FPHY和FBIO如下：
F0＝D121×（LogN0－Log NF）＝8分鐘
生物負載法需有實(shí)測產(chǎn)品活菌計數和耐熱性篩選程序。必須取得足夠的有關(guān)生物負載數據，亦建立歷史資料。對生物負載篩選次數的要求，取決于歷史資料的質(zhì)量和變化情況，被滅菌產(chǎn)品的種類(lèi)、生產(chǎn)工藝和滅菌工藝的類(lèi)型等等。若生產(chǎn)環(huán)境發(fā)生了變化，應考慮對生物負載進(jìn)行補充監測。
對生物負載耐熱性的測定，可將含生物負載產(chǎn)品樣本在推薦滅菌工藝下作分級遞增暴露時(shí)間處理，然后進(jìn)行無(wú)菌檢查試驗，以測定在不同的暴露時(shí)間內存活的菌量，或存在的陽(yáng)性樣本比例。作為一種替代方法，生物負載微生物的耐熱性可通過(guò)分離和繁殖，隨后接種在產(chǎn)品上或適當載體上進(jìn)行測定。不過(guò)，要注意繁殖會(huì )改變生物負載的抗性。此外，還應對常規生物負載的微生物耐熱性進(jìn)行測定。
就生物負載而論，具有濕熱高度耐熱性的微生物菌株有：生胞梭菌（Clostridium sporogenes），凝結芽孢桿菌（Becillus coagulans），枯草芽孢桿菌和嗜熱芽孢桿菌等。
以生物負載法為依據的滅菌工藝，需經(jīng)常進(jìn)行微生物篩選，以測定與產(chǎn)品有關(guān)的生物負載數量和種類(lèi)。在常規生產(chǎn)中，應從每一種生產(chǎn)設備中抽取具有代表性的產(chǎn)品樣本，并設計生物負載監測程序，對產(chǎn)品部件及生產(chǎn)中，包括環(huán)境和生產(chǎn)過(guò)程中，任何可明顯地影響生物負載地變化進(jìn)行評定。
2， 用于注射劑生產(chǎn)的輔助物料的滅菌工藝
用于注射劑生產(chǎn)的部分輔助物料在生產(chǎn)過(guò)程中與藥品直接接觸，因此同樣需要滅菌。它們包括：過(guò)濾器、膠塞、膠管、服裝、不銹鋼器皿、填充機械部件、清潔用品等等。一般通過(guò)與飽和蒸汽直接接觸而實(shí)現滅活，濕熱蒸汽的能量通過(guò)傳導或對流作用傳遞熱量。常用方法是建立能夠提供相同的**小滅菌保證水平的標準周期，再加上一定的安全系數，不管裝載物的內容是什么。
對于這類(lèi)物品，獲得可重復和可預測無(wú)菌保證的**大障礙是物品中潛在的空氣，所以適合的滅菌過(guò)程是先采用預真空過(guò)程，然后飽和蒸汽滅菌的方法。預真空過(guò)程的效果明顯優(yōu)于重力置換過(guò)程。
對于預真空滅菌程序，滅菌過(guò)程開(kāi)始之前對裝載物的處理是很重要的。如果每次的真空度為0.1個(gè)大氣壓，那么每個(gè)脈沖將使
滅菌器內的空氣減少90％或者1個(gè)對數單位?？梢栽黾訛槿齻€(gè)真空脈沖（蒸汽注入高于大氣壓，以避免空氣進(jìn)入滅菌腔室），使裝載物處于正常狀態(tài)。通過(guò)這個(gè)方法，空氣去除的效率會(huì )提高，平衡時(shí)間會(huì )縮短。
典型的重力置換程序建立在如下的理論基礎上：腔室中的冷空氣重于進(jìn)入的蒸汽并且將沉降到腔室的底部。蒸汽進(jìn)入腔室的時(shí)候，空氣和冷凝液一起從腔室底部的蒸汽疏水閥排出。去除空氣過(guò)程的成功取決于對蒸汽疏水閥的準確操作和合適的蒸汽分布。蒸汽一般通過(guò)導流板或多孔管注入
滅菌器腔室，如果蒸汽增加得過(guò)于迅速或者沒(méi)有合理分布，裝載物的頂部附近可能會(huì )產(chǎn)生氣穴，如果蒸汽增加得過(guò)于緩慢，空氣可能會(huì )被加熱而混入蒸汽中，從而使空氣去除更加困難。重力置換去除空氣的效率低于其他方法，不推薦用于空氣去除困難的物品。
對于多孔/堅硬物品的滅菌，需要確定以下操作參數（但不僅限于此）：
滅菌程序階段 對參數的說(shuō)明
滅菌程序全部 外殼溫度/壓力 外殼溫度不能超過(guò)或者明顯低于
滅菌器腔室的滅菌溫度。要控制溫度避免過(guò)度加熱或過(guò)度冷卻。#p#分頁(yè)標題#e#
監控探頭記錄探頭
必須獨立，并帶有合適尺寸的記錄紙以便記錄滅菌程序全部的溫度壓力變化值
加熱階段
真空脈沖的次數、范圍和持續時(shí)間（若使用）
用于多孔堅硬物品滅菌時(shí)的空氣去除
正壓力脈沖的次數、范圍和持續時(shí)間（若使用）
用于在滅菌程序開(kāi)始之前控制裝載物
腔室加熱
對于飽和蒸汽的滅菌方法，可以根據溫度和壓力的變化設置報警點(diǎn)
滅菌階段
滅菌時(shí)間
對每個(gè)滅菌程序都是重要的控制參數
滅菌階段的溫度
對每個(gè)滅菌程序都是重要的控制參數
滅菌階段的腔室溫度波動(dòng)
對每個(gè)滅菌程序都是重要的控制參數
值的累積
對于滅菌器自帶的測量探頭，**小值的記錄有利于滅菌程序的評價(jià)
冷卻階段
干燥時(shí)間
可以選擇加熱、真空等手段來(lái)干燥裝載物
真空解除速率
若需要，可以用來(lái)保護包裝或過(guò)濾器的完整性
若**后采用噴淋水降溫，則必須監控噴淋水的質(zhì)量。但是多孔/堅硬物質(zhì)不適合采用噴淋水降溫，一般采用抽真空或夾套降溫。比如過(guò)濾器，膠塞，膠管，服裝，不銹鋼器皿，填充機械配件，清潔用品等等。
對于滅菌裝載方式，需要注意以下幾點(diǎn)：
裝載物的類(lèi)型和結構要加以確認并記錄在案；Ø
裝載物不能接觸到滅菌艙室內壁；Ø
金屬箱表面與底座之間的接觸應減小到**低程度，通常使用有孔的支架，必要時(shí)也可以用可調節的支架；Ø
為了便于空氣去除，冷凝水排出和蒸汽穿透，要明確地確定裝載物地方位并記錄在案；Ø
質(zhì)量大的裝載物應放置在滅菌器中較低的架子上，以盡量減少被冷凝水弄濕；Ø
Ø控制滅菌器中物品的數量，如果裝載物的大小能夠改變，則需要確定**小和**大的裝載物，確認中間裝載物的合理插入法應包括**低負載中的**難滅菌物品；
如果確認研究表明物品的位置不影響滅菌效果，那么裝載的形式可能是可變的；Ø
裝載記錄可以作為操作人員的參考。Ø
4， 滅菌驗證的方法
滅菌過(guò)程的驗證和常規控制的相關(guān)內容包括滅菌設備的確認、滅菌工藝的驗證、包裝適用性、裝載試驗、空氣過(guò)濾器的檢查、蒸汽的質(zhì)量及管理、真空檢查和再驗證周期等等內容。
4.1 在蒸汽滅菌驗證進(jìn)行之前，需要確認以下內容：
蒸汽滅菌器制造商的質(zhì)量保證、
蒸汽滅菌器的檢查、安裝和性能確認、
安裝于
蒸汽滅菌器的空氣過(guò)濾器的泄漏試驗、
空氣流速或流型試驗（若必需）、
壓力或真空度測試、
蒸汽質(zhì)量測試（若必需）、
生物指示劑（化學(xué)指示劑）的挑戰性試驗、
不同裝載的驗證、
升溫時(shí)間的控制（若必需）、
保溫時(shí)間內的溫度波動(dòng)范圍、
對滅菌器進(jìn)行熱分布/熱穿透測試儀器的校準，
IQ/OQ/PQ的方案
具備證實(shí)能夠進(jìn)行IQ、OQ和PQ的所有內容并能對偏差進(jìn)行處理及糾正的能力。
4.2 一般來(lái)說(shuō)：驗證（IQ/OQ/PQ）必須包含：
4.2.1被測滅菌設備和公用系統的測試必須包含：
1.1 滅菌設備供應商的評價(jià)；
1.2 滅菌設備的容積、真空度、壓力以及泄漏率；
1.3 用什么作為滅菌介質(zhì)（如蒸汽、高壓空氣、過(guò)熱水等）并能證實(shí)有效；
1.4 滅菌設備如有夾層、夾層與氣室之間的壓力與溫度保持在什么水平上是安全的；
1.5 使用何種類(lèi)型的過(guò)濾器？多長(cháng)時(shí)間進(jìn)行挑戰性試驗？
1.6 使用何種類(lèi)型的監測和控制傳感器？如何校正？是否符合相關(guān)規定？
1.7 如滅菌設備中裝有蒸汽分流器，則必須消除系統運行安全的風(fēng)險；
1.8 時(shí)間、溫度、壓力、壓力消減速率的控制（若必需）；
1.9 空氣質(zhì)量、水質(zhì)量的控制以及報警（若必需）；
1.10 以上所有情況的變化是否評價(jià)再驗證的必要；
4.2.2 對滅菌工藝的驗證必須包含：
2.1 空載熱分布研究
2.2 熱穿透研究
每種裝載容器的每種裝載方式；
每種方式的運行次數；
每種方式的冷點(diǎn)是否確定；
2.3 升溫、降溫速度對生產(chǎn)工藝、產(chǎn)品的影響；
2.4 噴淋冷卻速度對被滅菌產(chǎn)品的影響；
2.5 冷卻用水是否能有效地控制微生物；
2.6 溫度測量系統是否提供每一個(gè)測點(diǎn)的打印數據；
2.7 溫度測量系統是否每次運行都進(jìn)行前后校正；
2.8 溫度測量系統的校正是否符合相關(guān)規定；
2.9 生物指示劑的使用：
類(lèi)型；
來(lái)源；
密度和D值；
是否采用生物負載法？是否測試被滅菌產(chǎn)品的初始菌？
如發(fā)生意外（陽(yáng)性），如何處理；
2.10 若出現熱穿透偏差如何處理；
2.11 若必需，提供污染菌（微生物負載）的特性及鑒別；微生物負載的報警及采取措施的限度；生物指示劑的鑒別、耐熱性及穩定性；污染菌與生物指示劑耐熱性的比較；微生物挑戰性試驗，用以證明在**短的滅菌周期內在**差條件下（如產(chǎn)品處在生物指示劑**難殺滅的位置或它屬于**難滅菌的產(chǎn)品或二者兼備的情況）；
2.12 對過(guò)度殺滅的風(fēng)險分析及管理；#p#分頁(yè)標題#e#
2.13 滅菌后的干燥程序對滅菌效果的影響；
2.14研究產(chǎn)品耐受性變更導致的滅菌工藝變化；
2.15總體評價(jià)并指導**佳滅菌效果的裝載量；
2.16 驗證及其相關(guān)項目的培訓
4.2.3 對于滅菌工藝的驗證，應符合以下規定：
1， 保溫時(shí)間內溫度波動(dòng)應在±0.5℃~±1.0℃之內（環(huán)境溫度變化變化應盡可能?。?；
2， 保溫時(shí)間內壓力波動(dòng)應在±5Kpa之內（若必需）；
3， 滅菌工藝驗證包含**小裝載、飽和裝載和典型裝載三種；或者采用**大裝載，**小裝載和混合裝載的兼容性研究；
4， 極限**低溫度與**大值相差不大于3K；
5， 等效滅菌時(shí)間的偏差不大于15s（對**大的滅菌設備不大于30s）；
6， 空氣過(guò)濾器的流速應不大于0.13Kpa/min（若必需）；
7， 空氣移除速度的檢查（若必需，適合多孔/堅硬物質(zhì)）；
8， 生物指示劑的布置；
9， 若必需，則需測被滅菌物品的初始菌（微生物負載）；
10， 以冷點(diǎn)為控制溫度；即確認所有測點(diǎn)均達到滅菌溫度后才計算標準滅菌時(shí)間。
5， 滅菌驗證形成的相關(guān)文件
5．1 相關(guān)文件要點(diǎn)
以下是對蒸汽滅菌器或蒸汽-濕熱滅菌工藝的相關(guān)驗證文件的分類(lèi)，可以根據實(shí)際情況作出篩選，但必須評估相關(guān)內容是否完整：
滅菌器制造商及其設備信息；
滅菌器的安裝報告；
**滅菌的情況、所有操作及控制文件，包括儀表、閥門(mén)、報警裝置以及相關(guān)設施的校驗等；
產(chǎn)品的安全耐受性研究報告
真空度以及壓力保障措施的驗證
泄漏率測試報告
蒸汽、水、壓縮空氣等輔助系統的質(zhì)量測試報告
包含冷點(diǎn)、裝載分布、熱分布、熱穿透等項目研究的IQ、OQ、PQ方案及報告
對驗證結果的總結和風(fēng)險分析，提出裝載指導報告
完整的操作記錄（也可以是表格）
維護保養程序以及記錄，包含預防性維護、條件維護等內容
任何變更、任何故障的處理報告
培訓記錄以及效果評價(jià)報告
再驗證周期的規定
其他
5．2 驗證文件要點(diǎn)
滅菌參數與被滅菌物品特性的確認
真空度（泄漏率）
蒸汽滅菌的初始菌控制（滅菌前物品的生物負荷的數量）
蒸汽滅菌中對于水、空氣過(guò)濾器等的要求
產(chǎn)品的安全耐受值
對過(guò)度殺滅的限制
挑戰試驗
再驗證周期
新的滅菌工藝的開(kāi)發(fā)
驗證實(shí)施步驟
偏差處理、風(fēng)險分析以及驗證報告
